Then I went to Militza Lozada’s poster. Her project was titled Generation of GFP Variants using Error Prone PCR and Characterization in Escherichia coli. She argued GFP’s (Green Flourescent Protein) usefulness as a marker to study when proteins are made and where they go. She mentioned how she amplified GFP using normal and error prone PCR conditions. This kind of PCR is done by adding extra Mg+ ions to the amplification reaction in order to promote errors during the amplification of the DNA by the polymerase. The purpose of this (and of the project itself) was to develop new GFP proteins.

Finally, I did not have enough time to visit L.M. Cruz’s poster. It was titled Development of a Biosensor using Hbl of Lucina Pectinata with Purification Methods and Characterization by Electroanalytical Technique. I learned that the purpose of the study was to observe the electrochemical properties of several biomaterials. It reports the purification methods for recombinant Hbl and Hbl/Sol-gel (TMOS) electrode, arranged by intermolecular interactions of the recombinant hemoglobin I from Lucina pectinata and TMOS in a carbon paste electrode.

I enjoyed showing my poster during the Poster Session and also I enjoyed reading and hearing my friends talk about their posters. However, I think it could have been a much more productive use of our time if professors from every university evaluated them and gave us feedback.

Durante estos meses, he estado trabajando muy fuertemente en mi investigación. Los objetivos de para estos meses incluían completar la transformación de Arabidopsis thaliana con los plasmidos B-CAS A and B-CAS B.  

Desafortunadamente, el cultivo B-CAS B se contaminó con hongo. Es por esto que he pasado mucho de mi tiempo desinfectando el cultivo. 

Aparte de este retraso, he logrado transformar una variedad de plantas y estoy en proceso de recolectar las semillas transgénicas. Luego de recolectarlas se sembrarán en medio de cultivo MS con Kanamicina.  Nuestro plásmido tiene la resistencia a este antibiótico. Cultivando la semilla en presencia de Kanamicina confirma la presencia del vector en la planta.  Finalmente un ensayo enzimático se utilizará en las hojas de las plantas transformadas para observar el nivel de expresión de los genes insertados.

Abstract:

Cassava constitutes one of the most important crops and a major source of calories for a great part of sub-Saharan Africa.  It has poor protein content, degrades very rapidly once harvested, and has a high content of cyanogenic glucosides linamarin and lotaustralin.  Since high concentrations of cyanide can be harmful to cassava, it produces a family of enzymes called β-substituted alanine synthase (βsas) that play several metabolic roles among which are the metabolization of cyanide.  With the purpose of studying cassava β-CAS expression, model plant Arabidopsis thaliana will be transformed with vectors containing either the β-CAS-A or β-CAS-B using Agrobacterium tumefaciens based plant transformation method.  Thus DNA will be extracted from the leaves and an enzymatic activity assay will be performed to asses the expression of the β-CAS gene.  Finally, the amount of cyanoalanine present in leaves will be determined spectrophotometrically at 650 nm and the amount of cysteine at 560 nm.

Durante este semestre, las metas de mi proyecto son las mismas. Sin embargo, se han extendido, ya que tengo que dividir mi tiempo entre mis clases y la investigación.

1) Deseamos lograr la transformación de Arabidopsis usando Agrobacterium que carga el vector binario con los genes de Cassava (Manihot Esculenta):
a. B-CAS A without Signal Peptide
b. B-CAS B without Signal Peptide
c. B-CAS A with Signal Peptide
d. B-CAS B with Signal Peptide

El semestre anterior estuve preparandome para poder llevar a cabo la transformación de Arabidopsis. Aprendí las técnicas que se utilizan en un laboratorio de Genetica Molecular: PCR y COLONY PCR, a hacer electrophoresis en geles de agarosa, a preparar medios de cultivo y cultivar Agrobacterium y llevar a cabo los ensayos enzimáticos que nos dan información a cerca de la actividad enzimática de los genes de cassava. También aprendí a esterilizar semillas de Arabidopsis para crecerlas en platos y luego en tierra.

Este semestre, estaré ampiando mis conocimientos y practicando estas técnicas. Practicaré la técnica de transformación genética conocida como Floral Dip Method. En este se utiliza una solución concentrada de Agrobacterium y un componente llamado Silwett-77. Este último ayuda en la penetración del vector a través de la pared y membrana celular de la planta. En este método, se sumerge brevemente el tallo de la planta en la solución con la bacteria en el momento en que las flores de la planta estan saliendo. Es de suma importancia hacer el procedimiento en este momento. Es en este momento en el cual se están formando las semillas y están receptivas a la manipulación genética. Si se lleva a cabo luego de que las flores abrieron, entonces la transformación no tendrá mucho éxito.

La mayor dificultad durante este semestre radicará en la cuidadosa distribución de mi tiempo. Espero tener éxito.

A pesar de que era un poco frustrante al principio, luego experimenté lo beneficioso que fue el estar expuesto a un laboratorio de investigación en genética mientras tomaba los cursos de Genética General y Microbiología.  Logré adquirir una idea general de la mayor parte de los conceptos por medio del laboratorio y luego recibí una explicación más teórica en la clase. Esto fue cierto para los temas de enzimas de restricción, amplificación de ADN, transformación de bacterias con vectores transformados, la clasificación de organismos por medio de cultivos en medios selectivos, etc.En términos de resultados, no logramos obtener todavía datos numéricos de los cuales pueda discutir ahora mismo. Esto se debe a que estabamos en la etapa de transformar la bacteria portadora del vector pKYLX (vector con los genes de cassava que estudiaremos) y confirmar su transformación mediante secuenciación de ADN.En estas semanas hemos estado estandarizando el método de transformar Arabidopsis (la planta en la cual observaremos la expresión del gen de cassava), buscando maximizar la razón de transformación.  De igual manera, hemos estado probando diferentes protocolos para medir la actividad enzimática de la proteína que codifica nuestros genes insertados.

El próximo semestre esperamos haber desarrollado un método eficiente de mantener amplias reservas de nuestra bacteria transformada y de transformar Arabidopsis.  Yo me encargaré de lograr la transformación exitosa de 20 plantas por cada gen de cassava estudiado.  Este trabajo me permitirá desarrollarme de forma más independiente.

En esta técnica se amplifica un pedazo de ADN utilizando primers de RNA específicos que permiten que DNA polimerasa comienze a replicar ese pedazo de ADN solamente.  Luego, se extrae la solución con ADN amplificado y se corre una electroforesis en una gel de agarosa, lo cual permite que se creen bandas de ADN de acuerdo a su densidad.  La formación de bandas en ciertos lugares específicos nos permiten determinar si el ADN estaba en la muestra de bacterias escogida o no.

Pienso que se ha logrado un progreso 2 de 5 de las metas propuestas en esta invesetigación.  El progreso debo admitir que es lento.  Sin embargo, esto se debe a que el análisis de las secuencias de ADN es algo que toma tiempo y esfuerzo.  Además que también dependemos de otras compañías para analizarlas y esto también toma tiempo.  Sin embargo, estamos aprovechando el tiempo practicando las técnicas aprendidas y planificando los próximos pasos a seguir.

En este semestre espero…

1.     aprender las técnicas utilizadas en el laboratorio

        a. llevar a cabo un PCR adecuadamente

        b. hacer minipreps y otros procedimientos para confirmar la presencia de nuestro plásmido en Agrobacterium

        c. identificar los primers necesarios para la transformación de Arabidopsis

2.     familiarizarme con los términos y los aparatos del mismo

3.     completar los objetivos expresados en la propuesta de nuestra investigación

4.     obtener resultados adecuados para escribir un “paper” o alguna presentación

During this semester I will be working under a different professor and with a different research topic.  I have switched from working with cellular penetration from an engineer’s perspective, to modifying entire organisms from the inside out.  I will be working in a Genetics and Biotechnology Laboratory under the guidance of Dr. Dimuths Siritunga, researching the function and interaction of two different genes present in cassava plants. Cassava (Manihot esculenta) is a crop with high output of energy per hectare, a quality that is desired by farmers in regions with high incidence of food shortages and rapid population growths.  It plays an important role in the diet of numerous countries around the world, where it is consumed in great quantities on a daily basis.  However, cassava produces cyanogenic compounds that when degraded release hydrogen cyanide.  The latter is a toxic compound for humans and so cassava must be adequately processed in order to make it safe.  Additionally, short cuts taken during times of war or famine allow for a greater concentration of cyanide compounds to remain in cassava, affecting the general health.  Consumption of hydrogen cyanide has been linked to several diseases such as Konzo, goiter, and cretinism.  Cassava has a natural process for degrading cyanogenic compounds that is important for the plant’s health and survival.  There are various byproducts, such as proteins and other molecules, which promote a greater survival rate.  For this reason, among others, these genes cannot simply be silenced and should be characterized.

During this semester I will be working with Susan Ponce, a graduate student, on her thesis project tit

led 

Functional analysis of the cassava B-CAS gene in Arabidopsis mutants.  Its purpose is to 

determine the function of this gene and its interaction, if any, with other genes with very similar functions.  Arabidopsis plants, mutant for the B-CAS gene, will be transformed with the gene from cassava in order to observe and compare its functional properties.  Furthermore, after its functional characteristics have 

been identified, this research will expand to genetically modify cassava to be more nutritious (Cassava ha

s high caloric content but is a poor source of proteins). 

**For further details on our research project visit the “Research Details” or the “Proposal” sections of the blog.

A traves del semestre, logramos establacer un balance.  Siempre coordinamos los experimentos por adelantado para que hubiera alguien en el lab.  En cuando a el sistema, todavia seguimos bregando con eliminar los errores y minimizar el que los equipos se rompan.

Para el semestre que viene, espero conseguir un laboratorio en genetica que sea igual de bueno que en el que estoy ahora.

Por ultimo, fue muy grata la experiencia de conocer diferentes investigaciones que se estan llevando a cabo en el recinto. Logre hacer comentarios en los blogs de las personas que accese.